摘要：目的研究细柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith中impressicacid（IA）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW.7的抗炎作用。方法以LPS诱导RAW.7细胞建立炎症模型；使用EZ4U细胞增殖与细胞毒性分析试剂盒检测IA对RAW.7细胞的毒性作用；Griess法测定一氧化氮（NO）水平；ELISA法测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）水平；RT-PCR法检测TNF-α、IL-1βmRNA表达；Westernblotting检测高迁移率族蛋白B1（HMGB1）蛋白表达；ELISA法细胞质和细胞核的核因子-κB（NF-κB）水平。结果Impressicacid可以显著抑制LPS诱导的RAW.7细胞中TNF-α、IL-1β水平和HMGB1蛋白表达，并抑制NF-κB从细胞质向细胞核的转移（P0.05、0.01）。结论细柱五加中IA对LPS诱导的RAW.7细胞具有抗炎作用。
细柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith为五加科五加属植物，广泛分布于湖南、安徽、河南等地，其干燥根皮收载于《中国药典》年版一部，具有祛风除湿、强壮筋骨、活血祛瘀、利水消肿的功效，常用于治疗脾肾阳虚、体虚乏力、风湿痹痛、筋骨痿软等[1-3]。课题组前期研究表明，糙叶五加A.henryi(Oliv)Harms、吴茱萸五加A.evodiaefoliusFranch.、朝鲜刺五加A.koreanumNakai、刺五加A.senticosus(Rupr.EtMaxim.)Harms等五加属植物中的提取物和化合物可以抑制炎症细胞中一氧化氮（NO）、前列腺素E2、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的产生[4-8]。因此，从五加属植物中寻找新的抗炎活性化合物具有可行性。impressicacid（IA）在五加科植物如三叶五加[9]、朝鲜五加[10-12]、细柱五加[13]、凹脉鹅掌柴[14]、台湾鹅掌柴[15]中广泛存在。课题组前期已经从细柱五加中分离出许多化合物[13,16-17]，其中IA的含量较高。
炎症是活体细胞对致炎因子、局部损伤所产生的防御性反应[18]。炎症细胞激活后产生的促炎介质导致慢性炎症[4,19-23]。脂多糖（LPS）可诱导巨噬细胞活化[24]，生成并释放多种炎症介质[25-27]。核因子-κB（NF-κB）在炎症级联瀑布反应中起关键作用[28]，当细胞受到LPS刺激时，促使NF-κB从细胞质易位到细胞核，从而调节炎症相关基因的表达[29]。细胞核内的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）作为晚期的炎症介质[30]，可参与基因转录的调控[31-34]。脓毒症患者血液中HMGB1水平常在晚期（16～24h）升高[35]。研究表明，在动物模型中针对早期炎症因子使用相应抗体或拮抗剂可抑制脓毒性休克的发展[36-38]，但在临床治疗中难以及时干预，未能达到理想治疗效果[39-40]。HMGB1在炎症过程中具有的潜在中心作用，使其成为炎症治疗的靶标[41]。抑制HMGB1释放的机制与NF-κB信号通路有关[42]。因此，通过抑制HMGB1表达对炎性疾病进行治疗，还需研究NF-κB信号通路对HMGB1分泌的影响。为探究IA的抗炎作用，本研究通过LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW.7建立炎症模型，考察IA对LPS诱导的RAW.7细胞中NO、TNF-α、IL-1β、HMGB1水平以及NF-κB信号通路的影响。
1材料
1.1试剂
细柱五加叶于年9月在湖南长沙市郊采集，由韩国庆熙大学陆昌洙教授鉴定为五加科植物细柱五加A.gracilistylusW.W.Smith，标本保存于湖南中医药大学药学院（标本号为）。
LPS、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；地塞米松（DEX，批号S，上海Selleck公司）；EZ4U细胞增殖与细胞毒性分析试剂盒购自Biomedica公司；HMGB1抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗、增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；TNF-α、IL-1βELISA试剂盒、TRIzol试剂购自Invitrogen公司；RPMI培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；β-actin抗体（1∶）购自Santa公司；ECL化学发光试剂盒购自ThermoFisherScientific公司；细胞核/胞质细胞组分提取试剂盒购自Biovision公司；NF-κBp65ELISA试剂盒购自CellSignalingTechnology公司。
1.2仪器
JEOLJNMECP-核磁共振仪（日本电子株式会社）；Q-TOFmicroLC-MS/MS质谱仪（美国Waters公司）；YLHPLC系统（韩国英麟公司）；CentriconYM-10型超滤器（美国Millipore公司）；连续波长多功能酶标仪（奥地利Tecan公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；96孔板（美国Corning公司）。
1.3细胞
RAW.7细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。
2方法
2.1IA的制备
取1kg干燥的细柱五加叶，粉碎后以甲醇加热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩后得到g总浸膏。总浸膏溶解于蒸馏水，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇进行萃取，回收溶剂后得到石油醚部分6g、醋酸乙酯部分42g、正丁醇部分58g。将25g醋酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离，分别以氯仿-甲醇（25∶1、20∶1、15∶1、10∶1）梯度洗脱，得到流分Fr.1～4。将Fr.1（2.2g）经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇（25∶1）洗脱，得到IAmg。根据质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱等波谱数据鉴定化合物的结构[10]，如图1所示。采用HPLC测定IA的质量分数大于98%。
2.2细胞培养
RAW.7细胞用含10%FBS的DMEM培养基，于5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。
2.3细胞毒性测定
采用EZ4U细胞增殖与细胞毒性分析试剂盒检测IA对RAW.7细胞的毒性作用。将处于对数生长期的RAW.7细胞以1×个/孔接种于96孔板，培养8h。设置对照组和IA组，IA组分别加入不同浓度的药物（5、25、50、75、μmol/L，IA以0.1%DMSO溶解），对照组加入0.1%DMSO，培养48h后，每孔加入20μLEZ4U试剂，于37℃培养4h。用酶标仪在nm（参比波长nm）波长处测定吸光度（A）值，计算细胞存活率。
细胞存活率=A给药组/A对照组
2.4Griess法测定NO水平
取处于对数生长期的RAW.7细胞，以2.5×个/mL接种于96孔板中，培养12h，设置对照组，LPS组，IA（10、20、30、40、50μmol/L）组。IA组加入不同浓度的药物，除对照组外，其余各组均加入LPS（ng/mL），孵育24h。取μL细胞上清液与μLGriess试剂混合，于室温下孵育10min，使用酶标仪测定nm处的A值[19,25]。
2.5ELISA法检测TNF-α、IL-1β水平
取处于对数生长期的RAW.7细胞，以1×个/孔接种于12孔板中，培养12h，设置对照组、LPS组、DEX（10μmol/L）组、IA（10、20、30、40、50μmol/L）组。DEX组、IA组加入不同浓度的药物，除对照组外，其余各组均加入LPS（ng/mL），孵育12h。收集上清液，按照ELISA试剂盒说明测定TNF-α、IL-1β水平。
2.6RT-PCR法检测TNF-α、IL-1βmRNA表达
将处于对数生长期的RAW.7细胞以1×个/孔接种于12孔板，培养8h。设置对照组、LPS组、IA（10、20、30、40、50μmol/L）组。IA组加入不同浓度的药物孵育1h后，除对照组外，其余各组加入LPS（ng/mL）孵育2h。PBS洗涤2次，加入TRIzol试剂，提取总RNA。通过反转录试剂盒得到cDNA，再用相应引物进行PCR分析，检测TNF-α、IL-1βmRNA表达。引物序列如下，TNF-α正向引物为5’-GAATGGGTGTTTTCATCC-ATTCT-3’，反向引物为5’-GCTTAAGTGACCTCG-GAGCTTACA-3’；IL-1β正向引物为5’-TTGACGG-ACCCCAAAGAGTG-3’，反向引物为5’-ACTCCT-GTACTCGTGGAAGA-3’；β-actin正向引物为5’-ATGGTGGGAATGGGTCAGAAG-3’，反向引物为5’-GGAAGATGTTACTCGACGAGC-3’。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察[19,25]。
2.7Westernblotting法检测HMGB1蛋白表达
取RAW.7细胞以1×个/孔接种于12孔板，培养8h。设置对照组、LPS组、IA（10、20、30、40、50μmol/L）组。IA组加入不同浓度的药物孵育1h后，除对照组外，其余各组加入LPS（ng/mL）孵育24h。吸取细胞培养液上清液加入CentriconYM-10超滤器中，离心、滤过并浓缩，浓缩的样品于－80℃保存。
收集细胞，用预冷的PBS洗涤3次，加入μL细胞裂解缓冲液（50mmol/LTris、mmol/LNaCl、1mmol/LPMSF、0.1%SDS、0.02%叠氮化钠、1%NonidetP-40）置冰上裂解细胞，收集细胞。超声30s后于4℃离心30min，取上清液于－80℃保存，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。
蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜。加入5%脱脂奶粉，于室温封闭1h，分别加入HMGB1、β-actin抗体于4℃孵育过夜。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（1∶），于室温孵育1h。洗涤后，使用ECL发光试剂盒检测HMGB1蛋白表达，采用QuantityOne软件进行分析。
2.8细胞核NF-κB活性检测
取RAW.7细胞以1×个/孔接种于12孔板，培养8h。设置空白组、对照组、LPS组、IA（10、20、30、40、50μmol/L）组。IA组加入不同浓度的药物孵育1h后，除空白组和对照组外，其余各组加入LPS（ng/mL）孵育2h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤3次，使用细胞核/胞质细胞组分提取试剂盒分离细胞质和细胞核，按照ELISA试剂盒说明检测细胞核中NF-κB水平。
2.9统计学分析
数据以表示，采用SPSS16.0软件对实验数据进行分析，组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
3结果
3.1IA对RAW.7细胞活力的影响
如图2所示，IA（75、μmol/L）显著降低细胞存活率（P＜0.05），具有明显的细胞毒性；IA（5～50μmol/L）对细胞存活率均无显著影响。因此，后续实验所使用的IA浓度不超过50μmol/L。
3.2IA对NO水平的影响
如图3所示，静息状态下RAW.7细胞产生（3.68±0.37）μmol/LNO；LPS组RAW.7细胞NO水平显著增加（P＜0.01），为（9.01±0.51）μmol/L。IA组NO水平显著降低（P＜0.05、0.01），呈剂量相关性。提示IA对NO的产生具有良好的抑制作用。
3.3IA对TNF-α、IL-1β分泌的影响
TNF-α、IL-1β是参与调节免疫应答、造血、炎症的多功能促炎细胞因子。如图4所示，与对照组比较，LPS组TNF-α、IL-1β水平显著升高（P＜0.01）；与LPS组比较，IA组TNF-α、IL-1β水平显著降低（P＜0.05、0.01），呈剂量相关性。提示IA可抑制促炎介质TNF-α、IL-1β分泌。
3.4IA对TNF-α、IL-1βmRNA表达的影响
如图5所示，与对照组比较，LPS组TNF-α、IL-1βmRNA表达显著增加；与LPS组比较，IA组TNF-α、IL-1βmRNA表达显著降低，与ELISA法测定的TNF-α和IL-1β分泌结果一致。
3.5IA对HMGB1蛋白表达的影响
HMGB1是一种细胞内蛋白质[43]，当其存在于细胞外时，为免疫系统充当坏死标志物。研究表明，受损或坏死的细胞可以将HMGB1释放到细胞外，从而引发炎症反应[44]。如图6-A所示，与LPS组比较，IA组细胞上清液中HMGB1蛋白水平显著降低（P＜0.05、0.01），呈剂量相关性。如图6-B所示，不同浓度的IA均对细胞内HMGB1蛋白表达没有明显改变。上述结果表明IA能显著降低HMGB1分泌，但对RAW.7细胞中HMGB1蛋白的稳态水平没有影响。提示IA可能通过抑制HMGB1分泌，发挥抗炎作用。研究表明，LPS刺激巨噬细胞后，可与HMGB1结合形成复合物，进而抑制HMGB1的出核与释放，胞外HMGB1水平降低，并且HMGB1与LPS复合物的致炎活性远远大于同剂量的LPS[45-48]。
3.6IA对NF-κB活性的影响
如图7所示，与对照组比较，LPS组NF-κB水平显著上升（P＜0.01）；与LPS组比较，IA组NF-κB水平显著降低（P＜0.05、0.01），呈剂量相关性。提示IA可通过抑制NF-κB信号通路，从而减轻炎症反应。
4讨论
HMGB1可以通过刺激多种细胞合成、释放促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等[49]，参与炎性疾病的发病过程[11,50]，从而加剧炎症反应[51]。脓毒症的发病机制与炎症反应密切相关。研究表明，在脓毒症动物模型中，HMGB1蛋白抑制剂或拮抗剂能显著降低致死性内毒素血症和急性组织损伤的发生率[52]。因此，HMGB1可能是降低脓毒症患者死亡率和并发症的靶点。
细柱五加药用历史悠久，科研工作者对其次级代谢产物开展了较多药理学研究，但IA的潜在抗炎作用尚未阐明。本研究表明，IA显著减少LPS诱导的RAW.7细胞中NO、TNF-α、IL-1β炎性介质的产生，抑制HMGB1分泌和NF-κB活性。
综上所述，细柱五加中羽扇豆烷型三萜IA可通过抑制巨噬细胞中NF-κB活化发挥抗炎作用，并抑制TNF-α、IL-1β、HMGB1表达，指示IA可作为治疗炎性疾病如风湿性关节炎、类风湿性关节炎、颈椎病、腰椎间盘突出等的药物或先导化合物。但IA对脓毒症动物模型的全身炎症反应和重要器官损伤的保护作用、IA的生物利用度等仍需进一步研究。本研究表明细柱五加具有一定的开发前景，从细柱五加中筛选更多有效化合物及其作用机制研究，可为细柱五加的临床应用提供理论依据和实验基础。
参考文献（略）
来源：肖瑾，李小军，黄建军，高圣权，陆昌洙，刘向前．基于NF-κB信号通路的细柱五加中impressicacid的抗炎作用研究[J].中草药,,51(22):-.
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